1、熒光共振能量傳遞 （FRET）

 

    某熒光標(biāo)記基團(tuán)在激發(fā)光刺激下生成某波長的發(fā)射光，當(dāng)另一屏蔽基團(tuán)與其距離合適時，原發(fā)射光將會被屏蔽基團(tuán)所吸收，并轉(zhuǎn)化為其他波長的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET。

 

    2、熒光化學(xué)：

 

    安捷倫 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

 

    二、安捷倫 熒光定量PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計原則

 

    1、靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性（漏檢）。

 

    2、檢測片段的確定：選擇檢測組內(nèi)的保守 （突變少）（避免假陰性）、組間特異的序列 （突變多）（避免假陽性）作為引物探針的設(shè)計位置。片段長度70-150bp。

 

    3、引物：長度17-25bp;GC含量30-80%;退火溫度（Tm值）58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（自由能大于-3.5kc/m）；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，后5個堿基內(nèi)避免兩個以上的G或C。

 

    4、探針：長度20-30bp（Taqman）或16-25bp（MGB）；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) （自由能大于-3.5kc/m）；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大（多聯(lián)檢測）或Fam（單聯(lián)檢測）的熒光標(biāo)記。

 

    三、安捷倫 熒光定量PCR特點和優(yōu)勢

 

    1、特異性強(qiáng)：引物和探針的“雙保險”，避免檢測的假陽性。

 

    2、靈敏度高：分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期，自動化儀器收集熒光信號，避免了許多人為因素干擾。

 

    3、避免污染：全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理。

 

    4、實現(xiàn)定量：運用標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合Ct值進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

 

    5、高效低耗：可實現(xiàn)一管多檢。

 

    6、操作簡便：在線式實時監(jiān)測擴(kuò)增結(jié)果，不必接觸有害物質(zhì)。

 

    7、快速：反應(yīng)時間<1.5小時。

 

    四、安捷倫 熒光定量PCR實用意義：

 

    1、提高檢測效率，縮短檢測周期，提高通關(guān)速度；

 

    2、降低檢測成本，提高經(jīng)濟(jì)與社會效益。