混合模板DNA和有熒光素的Taqman探針，遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律使高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)完成，切斷和模板DNA互補配對的Taqman探針，熒光素在反應(yīng)體系中游離。熒光在特定光激發(fā)下發(fā)出，被擴增的目的基因片段隨著循環(huán)次數(shù)的增加呈指數(shù)級增長，Ct值根據(jù)實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度求取出來，同時對照多個已知模板濃度的標準品，就能夠使待測標本目的基因的拷貝數(shù)得出。

　　熒光定量PCR儀需要規(guī)范樣品核酸提取和實時熒光擴增時的操作，避免樣品交叉污染，酶被降解，出現(xiàn)假陽性的情況。

　?。?）根據(jù)試驗的分區(qū)嚴格操作，按照提取區(qū)、擴增區(qū)、檢測區(qū)單方向流動，不能夠逆向流動物品、樣品和試劑。

　?。?）在對多份樣品進行操作的時候，制備反應(yīng)混合液，首先混合好熒光PCR反應(yīng)液、熒光探針和酶。之后在每個PCR管中進行分裝，如此不僅會使操作次數(shù)減少，而且能夠使污染避免，還能夠使反應(yīng)的精確度增加。

　?。?）在對樣品和蛋白酶k添加的過程中，要對避免酶的降解和樣品的交叉污染尤其留心。

　　（4）在操作的時候，需要將陰性及陽性對照設(shè)立，能夠?qū)晒釶CR反應(yīng)的準確性和可信性進行驗證。

　?。?）使用的離心管、槍頭和PCR管需要確保沒有污染，或者將它們進行高壓滅菌。

　　（6）在完成核酸的提取之后應(yīng)當立刻進行儀器的擴增，不能夠在室溫環(huán)境下過長時間放置提取的核酸，空氣中的酶能夠輕易的將其降解，其可以在－70℃冰箱內(nèi)長期保存，在－20℃冰箱內(nèi)短期保存。

　?。?）因為產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA會很容易對移液器造成污染，所以需要使用可高壓處理的移液器。